IDENTIFICACION DE BACTERIAS

Sacamos una pequeña muestra de las bacterias con un  luego le echamos dos gotas de CRISTAL VIOLETA por 60seg y lavamos con agua destilada, luego le echamos dos gotas de LUGOL por 60seg y lavamos con el agua destilada, luego le echamos dos gotas de ALCOHOL ACETONA por 15seg y lavamos con el agua destilada, por ultimo le echamos dos gotas de FUCSINA  por 60seg lavamos y miramos en el MICROSCOPIO  y nos dimos cuenta que las bacterias que estavamos identificando eran COCOS, GRAMPOSITIVAS, BACILOS GRAMNEGATIVOS.

TINCION DE GRAM

La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

Metodologia

• Recoger muestras.
• Hacer el extendido en espiral.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos.
• Enjuagar con agua.
• Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s.
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
• Enjuagar con agua.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Explicación

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol está formado por I₂ (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I₂/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

PASTEURIZACION

 

Bacterias del cólera.

La pasteurización, a veces denominada pasterización, es el proceso térmico realizado a líquidos (generalmente alimentos) con el objeto de reducir los agentes patógenos que puedan contener: bacterias, protozoos, mohos y levaduras, etc. El proceso de calentamiento recibe el nombre de su descubridor, el científico-químico francés Louis Pasteur (1822-1895). La primera pasteurización fue realizada el 20 de abril de 1864 por el mismo Pasteur y su colega Claude Bernard.
Uno de los objetivos del tratamiento térmico es la esterilización parcial de los alimentos líquidos, alterando lo menos posible la estructura física, los componentes químicos y las propiedades organolépticas de estos. Tras la operación de pasteurización, los productos tratados se enfrían rápidamente y se sellan herméticamente con fines de seguridad alimentaria; por esta razón, es básico en la pasteurización el conocimiento del mecanismo de la transferencia de calor en los alimentos. A diferencia de la esterilización, la pasteurización no destruye las esporas de los microorganismos, ni elimina todas las células de microorganismos termofílicos.
El avance científico de Pasteur mejoró la calidad de vida al permitir que ciertos productos alimenticios básicos, como la leche, se pudieran transportar largas distancias sin que la descomposición los afectara. En la pasteurización, el objetivo primordial no es la "eliminación completa de los agentes patógenos" sino la disminución sensible de sus poblaciones, alcanzando niveles que no causen intoxicaciones alimentarias a los humanos (suponiendo que el producto pasteurizado se haya refrigerado correctamente y que se consuma antes de la fecha de caducidad indicada). En la actualidad, la pasteurización es objeto de cada vez más polémicas en ciertas agrupaciones de consumidores a lo ancho del mundo, debido a las dudas existentes sobre la destrucción de vitaminas y alteración de las propiedades organolépticas (sabor y calidad) de los productos alimenticios tratados.


Procesos de pasteurización

Muchos envases de lácteos han sido pasteurizados con métodos que prolongan su vida de consumo.

La pasteurización es un proceso térmico realizado a los alimentos: los procesos térmicos se pueden realizar con la intención de disminuir las poblaciones patógenas de microorganismos o para desactivar las enzimas que modifican los sabores de ciertos alimentos. No obstante, en la pasteurización se emplean generalmente temperaturas por debajo del punto de ebullición (en cualquier tipo de alimento), ya que en la mayoría de los casos las temperaturas superiores a este valor afectan irreversiblemente ciertas características físicas y químicas del producto alimenticio; así, por ejemplo, si en la leche se sobrepasa el punto de ebullición, las micelas de la caseína se “coagulan” irreversiblemente (o dicho de otra forma, se "cuajan"). El proceso de calentamiento de la pasteurización, si se hace a bajas temperaturas, tiene además la función de detener los procesos enzimáticos. Hoy en día, la pasteurización realizada a los alimentos es un proceso industrial continuo aplicado a alimentos viscosos, con la intención de ahorrar energía y costes de producción.
Existen tres tipos de procesos bien diferenciados: pasteurización VAT o lenta, pasteurización a altas temperaturas durante un breve período(HTST, High Temperature/Short Time) y el proceso a ultraaltas temperaturas (UHT, Ultra-High Temperature).

 Proceso VAT

Fue el primer método de pasteurización, aunque la industria alimenticia lo ha ido renovando por otros sistemas más eficaces. El proceso consiste en calentar grandes volúmenes de leche en un recipiente estanco a 63 °C durante 30 minutos, para luego dejar enfriar lentamente. Debe pasar mucho tiempo para continuar con el proceso de envasado del producto, a veces más de 24 horas.

 Proceso HTST

Este método es el empleado en los líquidos a granel, como la leche, los zumos de fruta, la cerveza, etc. Por regla general, es el más conveniente, ya que expone al alimento a altas temperaturas durante un período breve y además se necesita poco equipamiento industrial para poder realizarlo, reduciendo de esta manera los costes de mantenimiento de equipos. Entre las desventajas del proceso está la necesidad de contar con personal altamente cualificado para la realización de este trabajo, que necesita controles estrictos durante todo el proceso de producción.
Existen dos métodos distintos bajo la categoría de pasteurización HTST: en "batch" (o lotes) y en "flujo continuo". Para ambos métodos la temperatura es la misma (72 °C durante 15 segundos).

• En el proceso "batch" una gran cantidad de leche se calienta en un recipiente estanco (autoclave). Es un método empleado hoy en día, sobre todo por los pequeños productores debido a que es un proceso más sencillo.
• En el proceso de "flujo continuo", el alimento se mantiene entre dos placas de metal, también denominadas intercambiador de calor de placas (PHE)^[] o bien un intercambiador de calor de forma tubular. Este método es el más aplicado por la industria alimenticia a gran escala, ya que permite realizar la pasteurización de grandes cantidades de alimento en relativamente poco tiempo.

 Proceso UHT

El proceso UHT es de flujo continuo y mantiene la leche a una temperatura superior más alta que la empleada en el proceso HTST, y puede rondar los 138 °C durante un período de al menos dos segundos. Debido a este periodo de exposición, aunque breve, se produce una mínima degradación del alimento. La leche cuando se etiqueta como "pasteurizada" generalmente se ha tratado con el proceso HTST, mientras que para la leche etiquetada como "ultrapasteurizada" o simplemente "UHT", se debe entender que ha sido tratada por el método UHT.^[10]
El reto tecnológico del siglo XXI es poder disminuir lo más posible el período de exposición a altas temperaturas de los alimentos, haciendo la transición de altas a bajas temperaturas lo más rápida posible, disminuyendo el impacto en la degradación de las propiedades organolépticas de los alimentos; por esta razón, se está investigando la tecnología basada en microondas, que permite este tipo de efectos (es empleado incluso en carnes).^[11] Este método es muy adecuado para los alimentos líquidos ligeramente ácidos (la acidez se mide con el pH), tal como los zumos de frutas y los zumos de verduras (como el gazpacho), ya que permite períodos de conservación de 10 a 45 días si se almacenan refrigerados a 10 °C.

MEDICIÓN DE LA ACIDEZ EN VINOS

La acidez de los vinos en general es importante por las características de sabor que les imparte, pero es mucho más significativa por las condiciones que puede establecer para el crecimiento de la levadura y por tanto para una buena fermentación.
Al elaborar vino de frutas es fundamental llevar la acidez del mosto a valores óptimos de fermentación, por lo cual debemos conocer su valor inicial y poder así calcular la cantidad de ácido que debemos agregar o la dilución que debemos realizar.
Cuando se determina la acidez de una pulpa, el cálculo es diferente según sea el ácido que predomine en ella. Debemos entonces conocer el ácido predominante antes de hacer la determinación respectiva. Como referencia general, consideraremos la siguiente tabla de presencia de ácidos según la fruta.

Ácido	Predominante en
Tartárico	Uva, tamarindo
Málico	Manzana
Cítrico	Otras frutas

La acidez en vinos y mostos puede ser determinada mediante diversos métodos de laboratorio. Sin embargo, la volumetría, o titulación ácido base, es la más adecuada para nuestros fines. Este método se fundamenta en el cambio de color que sufre un indicador que está en medio ácido cuando es neutralizado con una base. Conociendo el volumen de base empleado, se podrá calcular el volumen de ácido en la muestra.
Para elaboraciones artesanales o caseras pueden emplearse los útileskits de acidez, que dan una buena aproximación para efectos prácticos. Elaboraciones profesionales requerirán mayor precisión, por lo que se recomienda la siguiente metodología.

Determinación de Acidez Total por Titulación Ácido-Base

Procedimiento
Llenar una bureta de 10 ml con solución de hidróxido de sodio 0,1 N. En un matraz de 250 ml de capacidad colocar 10 ml de muestra, unos 50 ml de agua destilada y 5 gotas de solución de azul de bromotimol al 1%. Agitando constantemente la muestra, dejar caer gota a gota la solución de hidróxido hasta que aparezca un color rosa pálido. Anotar el volumen de hidróxido empleado.

Cálculos
En el momento que el indicador cambie de color se habrá logrado la neutralización y se habrán igualado los números de pesos equivalentes del ácido y de la base.

Equivalentes de ácido = Equivalentes de base

Por definición,

Normalidad = Equivalentes / Volumen

Sustituyendo tenemos:

Volumen ácido x Normalidad ácido = Volumen base x Normalidad base

Como nos interesa conocer la Normalidad del ácido, despejamos:

Normalidad ácido = Volumen base x Normalidad base / Volumen ácido

Normalidad ácido = Volumen base x 0,1 eq/lt / 0,01 litro

Volumen base es el volumen de hidróxido empleado (bureta).
Si deseamos expresar esta concentración como gramos de ácido por cada litro de muestra, debemos multiplicarla por el peso equivalente del ácido correspondiente:

Ácido	Peso Equivalente
Cítrico	64
Tartárico	75
Málico	67
Acético	41
Láctico	78

Trabajando en mililitros, la expresión se resume en

Acidez (g/L) = Volumen de base x (Peso equivalente/100)

Una herramienta útil para realizar este y otros cálculos de manera sencilla es el programa Enocalc, hoja de cálculos enológicos

MEDICIÓN DE ALCOHOL EN VINOS

La medición del contenido de alcohol es de capital importancia en el proceso de elaboración de vinos debido fundamentalmente a dos motivos. El primero es normalizar el producto en cuanto a sus características y sus componentes. Obviamente, cada producto debe contener siempre la misma cantidad de alcohol, de azúcar, de acidez, etc., que es indicada en la etiqueta El segundo motivo es de origen fiscal, ya que el vino, como toda bebida alcohólica, está sujeto a pago de impuesto y por tanto el fabricante debe ser cuidadoso en el manejo de este componente para evitar sufrir gravámenes adicionales y penalizaciones.  Sin embargo, debe tenerse en consideración que en elaboraciones artesanales,  y principalmente en las caseras, la determinación de alcohol resulta de menor importancia que en las elaboraciones industriales y sólo estará en función de la legislación  establecida en cada país.

Un motivo frecuente por el cual nos consultan algunos productores es la confusión que surge cuando intentan medir el contenido de alcohol con un hidrómetro o alcoholímetro directamente en el vino y no obtienen ningún resultado. Nuestra recomendación siempre ha sido reiterativa: “CON UN DENSÍMETRO O ALCOHOLÍMETRO SÓLO SE PUEDE MEDIR ALCOHOL EN EL DESTILADO, NO EN EL VINO”. Esta recurrente consulta nos ha llevado a publicar esta pequeña reseña sobre el principal método de medición de alcohol en vinos, sus ventajas y desventajas.

Existe un buen número de metodologías diseñadas para la medición de alcohol (etanol) en el vino tradicional y en el vino de frutas, pero la principal y más universalmente extendida es la técnica densimétrica. Ésta se basa en la determinación de la densidad de una solución hidroalcohólica obtenida previamente por destilación del vino. La densidad puede ser medida a través de diversos instrumentos que el analista seleccionará según su conveniencia. Entre ellos están el hidrómetro, alcoholímetro, picnómetro y el ebullómetro.

PRACTICA

PRACTICA #1 VINO
El día viernes llegamos nos colocamos la bata y los guantes; lavasmos los implementos que se tenian que utilizar en la practica; luego pelamos las uvas y las maseramos hasta que las uvas quedaron casi liquidas luego medimos 6oo ML de agua y pesamos 150 G de azucar y lo revolvimos; lo colocamos en calentamiento a 79º C durante 30 minutos luego agitamos y por ultimo lo dejamos en reposo.

El día lunes llegamos y miramos como iba la muestra, la levadura ya estava haciendo efecto ya habia crecido y sacamos una pequeña cantidad para saber que tanta cantidad de azucar habia bajado y cunto habia subido de alcohol miramos en el refactrometro ( al principio estava a 30 brix ) esta ves estava a 25 brix luego lo pusimos ha destilar a 80ºC y al destilarlo salia una muestra del liquido aproximadamente de 100ML luego lo metimos al alcolimetro para saber cuanto alcohol habia subido y subio a 4% de alcohol.

El miercoles seguimos destilando otra muestra a 90º C sacamos otra ves 100ML de muestra  y lo medimos en el alcoholimetro y habia subido ha 6%.

El viernes continuamos con la destilacion a temperatura muy alta y sacamos otros 100ML de muestra y lo medimos en el alcoholimetro y ya iba en 10% de alcohol; el instructor nos dijo que al parecer ya habíamos terminado de hacer el vino pero tocaba esperar hasta la otra clase para saber bien como estaba el vino.

El dia miercoles llegamos y Juan Camilo nos dijo que sacaramos el vino,  y lo colocaramos a destilar; tambien medimos el alcohol 10% y tambien medimos los  BRIX y ya iva ha 14% nos dijo que ya estava listo que yano lo podiamos llevar para la casa y que le echaramos gelatina sin sabor para que quedara mejor.

Y PUES HACI FUE EL PROCEDIMIENTO PARA HACER EL VINO..........

PRACTICA #2 VINAGRE
Llegamos pesamos el azúcar y la levadura y las  revolvimos en 600ML de agua lo calentamos a calentar a 79º C    durante 30 minutos luego lo pusimos a fermentar.

En la siguiente clase llegamos y miramos como iba la muestra, la levadura ya estava haciendo efecto ya habia crecido y sacamos 100ML del alcohol y 100ML de AGUA  DESTILADA y pusimos a destilar; luego medimos la dencidad con un PICNOMETRO.

P ==  PESOPICNOMETRO MUESTRA  --  PESO PICNOMETRO VACIO
                                VOLUMEN DEL PICNOMETRO

P ==  56,6370GR -- 31,9885
                      24,774
___________
| P ==  0,9949 |

Y tenemos que la densidad es igual a 0,9949 

EQUIPOS UTILIZADOS

1 micro-centrifuga
2 microscopio
3 espectrofometro
4 baño termostato
5  agitador de tubos
6 ultra-congelador
7 autoclave
8 destilador
9 biscocimetrico
10 balanza
11 cámara de flujo laminal
12 incubadora
13 agitador orbital